Giám mục Nguyễn Anh Tuấn sinh ngày 26 tháng 12 năm 1962 tại thị xã Đà Nẵng, thuộc khu vực Nhà thờ chính tòa Đà Nẵng,[7] địa giới hành chính thuộc tỉnh Quảng Nam - Đà Nẵng (nay là phường Hải Châu 1, quận Hải Châu, thành phố Đà Nẵng), nguyên quán thuộc giáo xứ Gia Phổ (nay thuộc thị trấn Hương Khê, huyện Hương Khê, tỉnh Hà Tĩnh), thuộc Giáo phận Hà Tĩnh.[8] Theo tư liệu từ Tòa Thánh, ông sinh ngày 6 tháng 4 năm 1960,[9] với tên rửa tội Louis là theo vua Louis IX của Pháp. Trong gia đình, ông là người con thứ sáu trong số chín anh chị em gồm năm nam và bốn nữ (trong đó có hai người anh đã qua đời).[10][11]

Thân phụ ông là ông Giuse Nguyễn Văn Thị (1920 - 2001), nguyên quán thuộc tỉnh Hà Tĩnh, thân mẫu ông là bà Têrêsa Nguyễn Thị Hiếu, sinh năm 1929, nguyên quán Đà Nẵng. Hai ông bà buôn bán tại Đà Nẵng trước năm 1975.[11][12] Thân phụ ông rời Hà Tĩnh năm 1943 để theo đuổi con đường học vấn, vào miền Trung và kết hôn năm 1949.[8] Hiện gia đình ông đang sinh sống tại khu vực giáo xứ Thánh Gia, giáo hạt Tân Định, Tổng giáo phận Thành phố Hồ Chí Minh.[11]

Năm 1969, cậu bé Tuấn được gia đình đưa vào sinh sống và học tập tại Thành phố Sài Gòn. Thời niên thiếu theo học tại các trường Thánh Tâm (ở Đà Nẵng), Lasan Mossard (Thủ Đức), Lasan Taberd Sài Gòn, Trần Quốc Tuấn (còn gọi là La San Đức Minh) trong khoảng thời gian từ năm 1969 đến năm 1979. Cả gia đình ông sau đó đoàn tụ, sống tại khu vực giáo xứ Tân Định, Tổng giáo phận Sài Gòn.[11][13] Sau giai đoạn học phổ thông, Nguyễn Anh Tuấn vào Đại học Tổng hợp Thành phố Hồ Chí Minh (nay là Đại học Khoa học Tự nhiên) Khoa Toán - Tin học, tốt nghiệp Cử nhân Toán - Tin học (1979 – 1984). Sau khi tốt nghiệp, ông làm nhân viên điện toán trong vòng một năm tại Trung tâm Điện Toán Tổng Cục Bưu điện Sài Gòn,[11] rồi được đi thi hành nghĩa vũ quân sự từ tháng 8 năm 1985.[10][11] Ông được cử đi chiến trường Pnom Penh,[11] Campuchia và sống sót trở về Việt Nam. Ông về Thành phố Hồ Chí Minh tháng 7 năm 1987.[14]